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海洋环境中硫酸盐还原菌的快速测定方法研究

2021-03-26 03:14:01 hualin

  “一带一路”、“海洋强国战略”等重大战略规划为中国海洋经济带来了前所未有的发展机遇。海洋工程装备和船舶在服役过程中不可避免的要遇到各种腐蚀问题,其中由微生物引起的,或者由于其群体效应或代谢过程引起的腐蚀行为变化称做微生物腐蚀。微生物腐蚀几乎可以在所有常用工程材料表面发生,微生物腐蚀约占整个腐蚀的20%。作为微生物腐蚀研究的代表性微生物,也是研究最广泛的腐蚀微生物,硫酸盐还原菌 (SRB) 是一类能够利用SO42-为电子受体异化有机物质并从中获取能量的微生物,其参与的腐蚀过程约占所有微生物腐蚀的50%[1,2]。SRB广泛存在于海洋环境中,参与了工程材料在海洋底泥区、全浸区、潮差区和飞溅区的腐蚀过程,是一类不容忽视的腐蚀因子。

针对SRB加速腐蚀的机理研究已经经历了一个多世纪,目前已经形成的机理包括阴极去极化机理、浓差电池机理、代谢产物机理、酸腐蚀机理和电子直接传递机理等[3,4,5,6]。SRB的代谢活性与其腐蚀行为密切相关是这些机理的共识观点之一。如阴极去极化机理认为,SRB能够利用腐蚀阴极反应产生的氢原子参与SO42-的代谢过程,进而加速阴极反应平衡的移动,加速金属的溶解过程。浓差电池理论认为,SRB的生长代谢过程会降低在材料附近氧气的浓度,形成氧浓差电池,从而加速金属材料的腐蚀过程。代谢产物机理认为,SRB代谢产生的硫化物不仅本身对腐蚀反应具有阴极和阳极去极化作用,生成的硫铁化合物也具有去极化作用,同时硫化物还会破坏氧化物保护膜生成局部酸环境。酸腐蚀机理认为,SRB在代谢的过程中会不断产生低碳链的脂肪酸,这些脂肪酸,最主要的是醋酸,会造成局部环境pH值降低,从而加速对金属材料的破坏。电子直接传递机理认为,自养型SRB能够直接从金属基底材料获取电子参与其细胞代谢过程,导致腐蚀速率的显著增加,而不产生氢消耗。


然而,现有研究仍无法明确SRB状态对其腐蚀行为的影响程度和作用规律,其中一个重要原因是缺乏快速、准确、连续的SRB状态测定方法,导致无法及时获取关于SRB的种群浓度、生长状态和代谢效能信息。此外,受限于复杂的海洋环境,繁琐的微生物腐蚀样品采集流程,和电化学测试信号易被其它腐蚀行为掩盖等困难,目前仍没有合适的技术可以实现微生物腐蚀过程的实时监测。有研究报道,工程材料表面SRB的种群浓度和代谢活性可以为微生物腐蚀的发生提供指示[7]。因此,开发新型快速的SRB状态测定方法具有重要意义,能为深入揭示SRB在腐蚀过程中的作用机理,开发微生物腐蚀状态的快速监测技术提供重要依据。

目前,检测SRB种群浓度最常用的方法还是传统的最大可能数 (MPN) 法,该方法是由Abd-El-Malek等[8]在1958年首次提出。该方法将SRB进行逐级梯度稀释后进行定期培养,利用其代谢产生的硫化物与亚铁离子反应显色确定SRB的存在,根据稀释的倍数和呈现阳性显色样品的个数确定初始样品中SRB种群的浓度。虽然Vester等[9]在1998年对MPN法进行了改进,但该类方法仍然需要经历至少15 d才能完成整个检测过程,且操作过程繁琐,是一种既耗时又耗力的检测手段;同时过长的检测周期,使其检测结果并不能准确、实时地反映环境中SRB的种群数量,不利于施工和杀菌措施的调整。除最常用的MPN法外,目前已报道的其它SRB检测技术手段可以分为:基于SRB特征物质的检测方法,基于SRB细胞的检测方法以及基于SRB遗传物质的检测方法,这些检测技术均存在一定的缺陷与不足。例如,基于SRB特征化合物 (如腺苷酰硫酸还原酶) 的检测方法灵敏度及选择性均不高,且需要破坏SRB细胞结构[10];基于SRB细胞识别的检测方法 (如酶联免疫标记法) 受生物识别材料与生物标记材料的活性影响较大,检测信号不稳定[11];基于分子技术 (如聚合酶链反应-限制性片段长度多态性) 的分析方法需要较高的检测成本和专业人员操作[12]。因此,现有的SRB检测技术均存在普遍性与稳定性的不足,距离实际需求仍有较大的距离。

此外,目前常用的SRB活性测定方法是通过分析培养体系中营养物质的消耗情况和硫化物的积累量进行分析[13,14],该类方法受环境影响较大,尤其在开放体系研究时,营养物质的循环和硫化物的挥发均会对测定产生较大影响。同时,该类方法测定的是体系中SRB种群整体的代谢活性,无法实现材料表面固载细菌和溶液游离细菌活性的独立测定和区分。另一类基于微电极传感器的活性测定方法是通过解析生物膜表面硫化物的浓度变化确定SRB生物膜活性,然而该类方法对仪器设备和操作的要求较高[15,16,17],不适合现场和大规模应用。因此,现有测定技术均不能满足实际研究和应用的需求,无法快速、准确、连续的获得SRB的活性状态信息,开发新型的SRB代谢活性测定方法已成为微生物腐蚀研究的迫切需求。


事实上,海洋环境与SRB代谢过程非常复杂,目前常用SRB分析测量技术易受到非特异性吸附和干扰物质的影响,检测的准确度和重现性会有一定程度的降低。另一方面,现代科学研究和实际应用对微生物检测的需求已从单一宏观信号提升为单细胞的观测与分析,检测过程与结果需更加生动、形象。因此,引入其它新型检测技术实现环境中SRB种群浓度和代谢活性的快速检测分析已十分必要。


本文将简要介绍本课题组在SRB种群浓度和代谢活性检测方面的研究进展,阐述各类方法的优缺点、适用条件及检测性能,为后续SRB状态检测方法的发展及实用化提供参考。

1 SRB种群浓度快速测定方法研究进展

针对现有SRB检测方法的缺陷与不足,研究从微生物识别方式角度出发,实现了海洋环境中腐蚀微生物SRB的快速检测,将整个SRB检测流程缩短至2 d以内,有望部分甚至完全取代现有检测技术,具有较好的应用前景。

1.1 基于微生物细胞结构识别SRB的检测方法

为提升检测灵敏度及选择性,研究以海洋腐蚀微生物SRB细胞膜为识别目标,借助化学合成及电化学技术,构建了一系列快速检测技术,保证了SRB细胞检测的选择性,缩短了检测时间。主要进展如下:构建了无标记电化学快速检测平台实现了SRB的快速检测,其中多巴胺自激发检测平台 (图1) 是通过多巴胺在碱性溶液中的自聚合反应形成的聚多巴胺膜直接固定抗体作为识别平台,提升了检测平台的生物相容性,保证了生物识别材料的识别活性及检测选择性[18];三维泡沫镍结构检测平台是通过在三维镍结构修饰纳米金颗粒为固定抗体作为识别平台,提升了识别材料的固载效率,同时该三维结构能够有效放大检测信号,有效提升了检测灵敏度[19];分子自组装检测平台借助共价修饰结合无标记的电化学阻抗技术,实现了SRB的检测和分析,实现了SRB检测平台的有效构建,并具有良好的检测性能[20]。

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图1   多巴胺自激发检测平台的构建流程及检测性能评价[18]


其次,构建了纳米信标电化学平台实现了SRB的快速检测,其中氧化石墨烯标记检测平台 (图2) 是以高效新型纳米材料氧化石墨烯纳米片的高催化活性放大检测信号,进而实现了检测信号的有效放大,大大提升了检测灵敏度[21];纳米MnO2标记检测平台是以MnO2纳米材料作为信号标签,借助MnO2纳米材料催化性能实现SRB检测,具有更高的稳定性和更广的使用环境[22];壳聚糖电聚合检测平台是通过可控的电沉积技术制备石墨烯掺杂的壳聚糖膜固定抗体作为识别平台,实现了生物识别材料固载平台的可控调控,保证了检测平台的稳定性与均一性,同时具有较高的生物相容性[23]。

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图2   氧化石墨烯标记检测平台的构建流程及检测性能评价[21]


此外,开发了新型SRB特异性识别平台,其中生物印迹薄膜检测平台 (图3) 采用细胞介导技术在电极表面制备了能够识别SRB细胞的生物印迹薄膜,该技术具有价格低廉、稳定性好、适用范围广的优点[24];抗生素磁性分离检测平台通过特异性识别SRB细胞壁前质末端的D-Ala-D-Ala结构契合,借助石英晶体微天平技术对SRB进行测试分析。整个流程无需生物分子固定和修饰步骤,大大缩短了检测所需时间[25]。多巴胺增强聚合检测平台是构建了一种多功能的简便的信号放大体系,借助多巴胺材料增强聚合的过程实现生物材料及信号分子的有效固载,进而实现检测信号的靶向放大,提升了检测灵敏度[26]。

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图3   基于生物印迹薄膜检测平台的构建示意图及检测性能图[24]


基于微生物细胞结构识别SRB的检测方法灵敏度高,选择性好,检测时间短,能够在2 h以内完成检测过程,较易实现自动化检测。然而,大部分这类方法需要借助生物识别材料实现目标微生物的特异性结合,生物材料的活性易受到测试环境的干扰,且生物材料价格昂贵,不能重复使用。另外,生物材料过高的特异性也限制了其在实际环境检测中的应用,因为环境中SRB的种群数量巨大,目前已有40个属137种SRB被报道,每一种SRB的细胞成分都不尽相同。因此,基于微生物细胞结构识别SRB的检测方法适用于菌群结构单一、环境体系简单的检测体系。

1.2 基于微生物代谢过程识别SRB的检测方法

为提升检测稳定性,研究以海洋腐蚀微生物SRB的特征代谢产物为识别目标,构建了一系列快速检测技术。相关研究在保证了选择性的同时,避免了使用生物识别材料出现的稳定性差、价格昂贵、非特异性吸附不可避免等缺点。主要研究进展如下:构建了SRB代谢产物无标记快速识别检测技术,其中巯基蛋白酶活性条件检测平台 (图4) 是基于硫化物与半胱氨酸蛋白酶的活性巯基位点作用抑制其催化活性进而实现SRB的检测分析,既保证了检测稳定性,又提升了检测灵敏度[27];特异性微生物传感器检测平台利用Thiobacillus thioparus细菌内的硫化氢脱氢酶,实现对SRB代谢产生的硫化物的特异性识别,大大提升了检测稳定性[28];基于GSH-Au(Ⅰ)-Pb(Ⅱ) 配合物的荧光传感器,是基于Pb2+诱导的GSH-Au(Ⅰ) 聚集诱导发光,以及硫化物导致荧光猝灭现象,可对SRB代谢产物产生特异性响应,从而实现对SRB的快速检测[29];硫化铅标记检测平台将无机合成与溶出伏安技术相结合,以原位生物硫化铅为介体实现了目标微生物的靶向识别及快速检测,具有良好的检测性能[30]。

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图4   基于巯基蛋白酶抑制作用检测SRB的原理及性能图[27]


此外,构建了基于纳米信标的SRB代谢产物快速识别检测技术。其中,ZnS纳米光催化检测平台将光催化过程应用于微生物快速检测,构建过程融合了生物合成技术及光催化降解技术,既保证了检测稳定性,又有效提升了检测灵敏度[31];ZnO/ZnS阵列转化检测平台 (图5) 将纳米阵列过程引入微生物检测过程,借助纳米阵列的转化过程实现了SRB特征代谢产物的有效监测,该方法不受使用条件的限制,且具有批量生产的潜质[32];细胞代谢位发光平台结合微生物纳米合成技术在细胞内生成具有荧光特性的CdS纳米量子点颗粒,实现了目标微生物的荧光成像及快速检测。该检测技术稳定、可靠,不受检测条件的制约,具有很好的应用前景[33]。

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图5   基于ZnO/ZnS阵列转化检测平台检测SRB的原理图及检测性能[32]


基于SRB特征代谢过程的检测技术避免了使用生物识别材料出现的稳定性差、价格昂贵、非特异性吸附不可避免等缺点。同时,通过特征代谢产物硫化物实现对SRB的特异性快速检测还具有较高的普遍性,源自不同种群的SRB均可以通过这种方法检测。然而,基于SRB特征代谢过程的检测技术需要经历一个SRB预培养过程以在培养溶液中富集足够的硫化物,因此,需要借助纳米材料或生物酶类的灵敏性和放大作用缩短检测时间,这也是基于SRB特征代谢过程的检测技术的进一步发展方向。

1.3 基于微生物特征遗传片段的检测方法

以提升检测特异性及灵敏度,研究以微生物的特征遗传片段为识别目标,通过PCR技术扩增目标微生物的特异性DNA片段,利用DNA识别探针对微生物特征DNA片段的高选择性匹配、识别目标DNA片段,实现目标微生物的快速检测。主要研究进展如下:构建了遗传片段特异性放大检测系统,其中核酸外切酶Ⅲ循环放大检测平台是一种新型的基于新型磁性-DNA双链探针及核酸外切酶Ⅲ循环放大的检测方法,通过在磁性微球表面修饰的磁性-DNA双链探针,借助核酸外切酶Ⅲ特殊的剪切功能实现检测信号的循环放大,该微生物检测平台的灵敏度高,选择性好,简单易操作,应用性广[34];DNA纳米生物条码荧光检测平台 (图6) 是通过利用细菌DNA提取试剂盒将细菌总DNA提取出来,并用特异性引物进行PCR扩增以获得大量含有特异性目标片段的单链DNA,目标DNA链片段能部分与磁性微球的捕获探针结合,未结合部分将与磁性微球的捕获探针结合。通过磁性分离后,使用流式细胞仪测量结合有DNA-纳米生物条码的磁性微球[35]。

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图6   基于利用DNA纳米生物条码-荧光系统的检测微生物原理图及检测性能图[35]


此外,构建了基于新型酶标系统的遗传片段特异性放大检测系统,其中新型酶标体系信号放大检测平台 (图7) 是一种基于溶菌酶催化作用的荧光DNA传感器,溶菌酶被应用到微生物检测研究中。利用细菌DNA提取试剂盒将细菌中DNA提取、扩增后获得大量目标单链DNA片段,通过目标DNA链的“桥梁”作用将修饰有溶菌酶的信号DNA结合到磁性微球表面,溶菌酶催化底物产生荧光信号并用于微生物快速检测[36];基于脱氧核酶识别的银纳米簇荧光传感器,是以磁性微球为载体,以脱氧核酶为识别分子,引入乙酰胆碱酯酶,构建了一种MNP-DNAzyme-AChE (MDA) 复合物,用于微生物的高灵敏度检测。在存在目标细菌裂解液条件下,脱氧核酶可与其特异性结合,并发生催化裂解,使连接其上的乙酰胆碱酯酶,从MDA复合物中脱离进入溶液。利用乙酰胆碱酯酶的催化产物,使DNA银纳米簇的荧光信号发生增强,可实现对微生物的高特异性、高灵敏度检测[37]。

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图7   基于新型酶标体系信号放大检测平台检测微生物原理图[36]


基于微生物特征遗传片段识别微生物的检测方法具有极高的灵敏度和选择性,其中,16S rRNA序列分析中的基因片段具有多拷贝的特性,一个细菌对应103~105条16S rRNA 链,使得基于编码基因进行的分子生物学检测更灵敏;其次,其具有多信息的特性,编码基因由可变区和保守区组成,保守区为所有细菌所共有,细菌之间无差别,可进行细菌通用鉴定,可变区具有属或种的特异性,可据此进行细菌鉴定。然而,此类方法操作复杂,对检测人员技术要求高,且操作成本较高。因此,基于微生物特征遗传片段识别的检测方法适用于高专业技术支撑下对不同属种微生物的特异性鉴别及检测体系。

2 SRB生物膜代谢活性快速测定方法研究进展

为克服现有测定技术周期长,仪器复杂的缺点,本课题组研究开发了新型SRB生物膜代谢活性测定方法,借助电化学和荧光测试技术实现了SRB生物膜在形成初期的代谢活性动态测定与监测。


2.1 基于全固态离子电极测定SRB生物膜代谢活性

电化学技术能够实现SRB生物膜代谢活性的动态、连续监测,然而现有的微电极系统操作繁琐,设备昂贵。本课题组研究开发了两种高柔韧性全固态离子选择性电极,以石墨烯为离子-电子转换层,并在其表面原位制备了硫离子和pH值选择性薄膜,实现对目标离子的特异性、高灵敏度测定,同时研究还将其用于生物膜前期代谢活性的监测,获得了材料表面SRB生物膜代谢活性的变化趋势 (图8)。

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图8   全固态硫离子选择性电极的离子传导示意图及SRB生物膜代谢活性监测性能


2.2 基于荧光探针测定SRB生物膜代谢活性

本课题组研究开发了有机小分子硫化物荧光探针,不仅能够实现对生物膜中硫化物的稳定检测还能对其进行特异性荧光成像,解析SRB生物膜内代谢活性的空间分布状态。此外,研究利用SRB细胞增殖过程中,呼吸链中的NADPH/NADP,FADH/FAD,FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高,SRB代谢中间体还原可将刃天青还原为具有强的荧光特性物质,利用此特点来测定SRB生物膜代谢过程的活性变化,并实现了SRB种群浓度和活性状态的同时测定和对照分析 (图9)。

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图9   荧光探针测定SRB生物膜表面种群浓度和生物膜代谢活性


3 结论及展望

针对腐蚀微生物SRB的快速检测要比构建其它微生物检测方法复杂,因为SRB种群多种多样,分布广泛,目前已经有13个属,共计40余种SRB被报道出来。因此快速检测海洋环境中SRB最重要的是选择合适的识别方法。就目前的研究现状,最合适的SRB识别方式是通过其特征代谢过程实现对SRB的特异性识别,因为抗体等生物识别材料的高选择性限制了这些生物材料在SRB检测中的使用,不可能使用一种生物材料检测所有SRB种群的浓度;其次,生物印迹薄膜的选择性程度较低,能够产生干扰的物质较多。而且这两类识别手段的非特异吸附问题无法得到较好解决,对检测信号的干扰较大。通过特征代谢产物硫化物实现对SRB的特异性识别,在保证了选择性的同时,避免了使用生物识别材料出现的稳定性差、价格昂贵、非特异性吸附不可避免等缺点。同时,通过特征代谢产物硫化物实现对SRB的特异性检测还具有较高的普遍性,源自不同种群的SRB均可以通过这种方法检测。

然而,这类检测方法仍需较长的SRB培养时间以积累代谢产物硫化物。因此,进一步的研究将集中在继续缩短检测时间,主要是SRB培养时间方面,这对识别材料和检测技术提出了更高的要求。